超分辨荧光偏振成像
发布时间:2020-04-26 14:57:14 编辑:麓帮主 阅读次数:736

 

导读
近年来,研究者将一系列超分辨成像技术与荧光偏振显微术结合,实现了纳米尺度上乃至单分子水平的荧光偶极子成像。北京大学席鹏副教授课题组总结了已有的荧光偏振成像技术,介绍了最近开发的两种超分辨荧光偏振成像技术,比较了各种荧光偏振成像技术的优劣。该篇综述文章以“Super-resolution fluorescence polarization microscopy”发表在期刊 Journal of Innovative Optical Health Sciences 上。

作者简介

席鹏副教授,北京大学工学院研究员。致力于光学超分辨成像技术的研究,发展了一系列新型超分辨技术。2015年当选美国光学学会资深会员,和中国光学学会生物医学光学分会常务委员。现担任五份SCI收录国际学术期刊的编委:Light: Science and Applications, Advanced Photonics,Scientific Reports, Microscopy Research and Techniques, 和Micron。在Nature, Nature Methods等国际一流期刊发表SCI收录期刊论文60余篇。2016年获得中国光学重要成果奖。2018年获得北京市杰出青年科学基金。已授权美国专利3项,中国专利8项,编辑专著2部。多次被OSA和SPIE组织的国际会议邀请作大会邀请报告。

 

张昊博士,南方科技大学研究助理教授。2017年获得北京大学-美国佐治亚理工-埃默里大学三校联合博士学位,导师为席鹏教授。开发了一系列荧光偏振技术,如:(1)利用偏振特性的荧光偶极子超分辨技术(SDOM)发表在Light: Science and Applications期刊,并得到Nature Methods的高度评价;(2)参与将SDOM应用于金纳米粒子的SERS超分辨成像(Nanoscale 2018);(3)开发偏振结构光照明显微术(pSIM)并发表在Nature Communications期刊,该技术以高的空间分辨率和准确的偏振检测,揭示了肌动蛋白环在MPS中“并排”组装的新模型,推翻了以往教科书上的肌动蛋白环“端到端”的结构假设

 

 

综述背景

 

绝大部分荧光分子都是荧光偶极子,其光子吸收效率受激发光的偏振方向调制,它们发出的荧光也是偏振的。作为光的基本物理属性,荧光偏振在生物学研究中获得广泛应用。通过荧光偏振显微术(Fluorescence Polarization Microscopy, FPM),可以在测量荧光探针强度的同时测量偶极子的方向。由于荧光分子的取向与所标记的生物结构相关,荧光偏振成像可以揭示标记样本的结构信息。尽管X射线晶体学或电子显微镜可以获得单个蛋白质或大分子装配体的超高分辨率,但它们需要非常复杂的样品制备方法,不适合活细胞成像。近场成像技术,例如原子力显微镜(AFM)也可以提供与结构信息,但是被限制于样本表面的研究。荧光偏振显微成像能够以秒或毫秒为单位对动态样本中的分子方向进行成像,因此它可以作为测量亚细胞生物结构的一种补充方法。近几十年来,各种不同的荧光偏振成像技术被广泛用于细胞膜,细胞骨架,DNA链,以及其它生物大分子的研究中。
荧光偏振成像技术也在不断发展进化中,早期研究者们需要通过手动或机械方式来调制激发光偏振方向或者切换偏振检测通道。随着新型电光调制设备(Electro-optic Devices)的发展,成像速度和偏振探测精度都获得了大幅提升。而且,荧光偏振成像实现了与多种成像方式的结合使用,例如宽视成像,激光扫描共聚焦成像,双光子成像,全内反射成像等等。但是,作为一种光学成像技术,衍射极限限制了荧光偏振显微术的发展。与多种对荧光光强成像的超分辨技术相比,针对荧光偏振成像的超分辨技术仍处于起步阶段。
 

综述内容

 

1
荧光偶极子及生物结构标记
 

 

图1.荧光偶极子示意图。以绿色荧光蛋白(GFP)为例,它的偶极子取向(c-c’水平方向)与化学结构的关系如图所示。当荧光偶极子用来标记生物结构时,由于衍射极限的约束,荧光偏振显微术观察到的是衍射极限的多个荧光偶极子集合体。因此除了平均偶极子取向以外,研究者还通过集合偶极子摆动角来描述偶极子取向分布的有序无序。比如,在研究细胞膜时,集合偶极子摆动角的大小反应了脂质分子的有序性,可以进一步揭示膜的相位信息。

偏振调制下GFP荧光蛋白的光强变化

 

2
不同原理的荧光偶极子显微术

 

 

图2.三种不同的荧光偏振显微术的光路示意图。由于荧光偶极子的激发效率与激发光的偏振方向有关,因此可以通过偏振调制(又称为线性二色性)的方法来测量荧光偶极子取向,如图(b)所示。同时荧光偶极子发射的荧光信号也是偏振的,因此可以在探测端通过不同偏振通道来检测偶极子取向,图(a)中所采用Wollaston棱镜是一种产生不同偏振探测通道的方法。由于发射荧光的偏振特性,当荧光偶极子在成像中离焦时,离焦图案也会随偶极子取向变化,因此通过离焦图案识别的方法也可以检测偶极子取向,如图(c)所示。

 

3
不同原理的超分辨荧光偏振显微术

 

 

图3.两种超分辨荧光偏振显微术的原理介绍。第一种技术是超分辨荧光偶极子测绘技术(Super-resolution Dipole Orientation Mapping, SDOM),如图(a)所示。该技术利用一个旋转半波片来调制激发光的偏振方向,并结合稀疏反卷积进行偏振解调制,从而提升荧光偶极子成像的空间分辨率和取向角度分辨率。图(b)通过简单的仿真阐释了SDOM的原理:两个很近荧光偶极子(红色和绿色代表不同的取向)在宽场下完全无法区分,看起来像是只有一个荧光团;胆汁在偏振调制的情况下,可以明显观察到左右两个偶极子先后达到最亮,最终通过偏振解调制算法我们可以同时得到这两个荧光偶极子的位置和取向。第二种技术是结合单分子成像和荧光偏振显微术,其中最简单的是在单分子显微镜的探测端采用不同探测通道(如图(c)所示)分别进行单分子成像和定位,通过比较同一个荧光分子不同通道的强度来得到偶极子取向。单分子荧光偏振成像的优势是能够对每一个荧光偶极子单独成像。

 

4
超分辨荧光偶极子成像结果

 

 

图4.不同超分辨荧光显微术对肌动蛋白纤维的成像结果。图(a)是SDOM技术的成像结果,图(b)是偏振单分子成像结果,它们的偶极子取向由线段方向表示。图(c)是利用单分子追踪技术对活细胞肌动蛋白的成像结果,偶极子取向有色彩表示。比例尺:a,200 nm;b,1.5 μm;c,1 μm。

 

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最近,该课题组发展了偏振结构光成像技术(pSIM),并将其应用于多种不同的细胞器成像中。为了验证这一技术与SIM的广泛兼容特性,研究人员测试了多种商用SIM系统及自主搭建的SIM平台,以及2D-SIM、3D-SIM、TIRF-SIM成像能力,成功提取荧光分子的偶极子方位信息与超分辨结构信息。同时,研究人员进行了大量的生物学实验来证明pSIM广泛的适用性,如λ-DNA、BAPE细胞和小鼠肾组织中的肌动蛋白丝、肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互作用,以及中GFP染色的U2OS活细胞微管。
例如,在肌动蛋白actin和负责细胞输运的肌球蛋白myosin的相互作用中,研究人员发现,肌球蛋白在ATP驱动下,可以让肌动蛋白丝发生“漂移”。通过pSIM技术,可以对这一漂移的不同长度的肌动蛋白进行方向和运动的跟踪,而以往的SIM只能对其运动进行跟踪。

pSIM揭示了肌动蛋白actin和负责细胞输运的肌球蛋白myosin的相互作用

特别是,研究人员针对神经元中的膜相关周期骨架(MPS)进行了研究。pSIM以高的空间分辨率和准确的偏振检测,揭示了肌动蛋白环在MPS中“并排”组装的新模型,推翻了以往发表在Science上的肌动蛋白环“端到端”的结构假设。

图5.pSIM揭示了肌动蛋白环在MPS中“并排”组装的新模型,推翻了以往的肌动蛋白环“端到端”的结构假设。

 

讨论与总结

 

 

表1 不同荧光偏振成像技术的比较
单偶极子追踪成像可以在微秒时间尺度上实现单个分子的位置跟踪和偶极方向测量。定位精度可能高达几纳米。它在研究肌球蛋白(myosin)的旋转运动和ATPase 的步进旋转旋转等问题时取得了巨大的成功。然而,单偶极子追踪只能用于稀释标记的样品,无法揭示样本的整体结构。偏振单分子成像(偏振随机光学重建技术,polar-dSTORM)通过对荧光探针进行开-关调制并获取足够的帧来重建超分辨率图像。它的成像分辨率高,定位精度可达数十纳米,但是缺点是成像时间长(2-40分钟),在成像期间样品需要固定,从而难以对活细胞样品进行成像。
超分辨荧光偶极子测绘技术SDOM则可以实现150 nm空间分辨率和亚秒时间分辨率的成像,同时获得高精度的取向角测量,可以被用于固定细胞和活细胞成像。与polar-dSTROM相比,SDOM 的缺点是只能测量平均偶极子,无法将单个荧光团的摆动信号与荧光团的取向分布区分开。此外,SDOM技术对没有偏振特性的样本成像时不能得到超分辨效果。
偏振结构光照明显微术(pSIM)普适于任意样本,能过获得两倍的空间分辨率提升(横向分辨率100 nm,轴向分辨率300 nm)。由于其高时空分辨率,结构光照明成像非常适合活细胞成像,近年来在亚细胞成像,细胞器互作研究等领域成果丰硕。而偏振结构光照明显微术能够在已有的SIM系统上直接使用,额外获得荧光偶极子的取向信息,在未来解决各种生物问题方面具有广阔的应用前景

 

 

 

论文链接:

 

https://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S1793545817300026

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